离子交换色谱是如何工作的？

     

　　生物分子具有能在溶液中电离并赋予分子特定净电荷的官能团。例如，蛋白质由带有氨基(-NH  2)和羧酸(-COOH)的官能团组成。蛋白质的3D结构决定了哪些氨基酸残基暴露在其表面。根据介质的pH值，这些残基被电离，使得分子表面带有正负电荷。在低pH值下，更多的氨基被质子化，蛋白质分子带有净正电荷。另一方面，在较高的pH值下，更多的羧酸基团被去质子化，产生的阴离子使蛋白质分子表面带负电荷。表面上离子化官能团的总数决定了表面净电荷，每个分子在任何给定的pH值下都有唯一的表面净电荷。蛋白质在其等电点(pI)是电中性的，等电点是一个特定的pH值，在该pH值下，分子上没有净电荷。
       

　　图1显示了IEX的分离机理。当极性或带电分析物被装载到离子交换柱中时，它们将静电结合到固定相颗粒表面上的带相反电荷的离子上。分析物分子表面的正电荷或负电荷越多，对固定相中带相反电荷的颗粒的静电吸引力越强。目标分析物的保留时间还取决于与固定相相互作用的次数。含有缓冲液和盐的含水流动相用于通过改变pH值或离子强度来洗脱结合的分析物。

　　通过增加洗脱缓冲液的离子强度在IEX分离分析物的示意图。从装载、吸附和洗脱到柱再生结束，分子在柱中移动。

　　图1:显示通过增加洗脱缓冲液的离子强度在IEX中分离分析物的示意图。


　　IEX过程有五个主要步骤：2

　　1.平衡——第一步，用初始缓冲液(初始缓冲液组合物)洗涤固定相，直到基线稳定并且洗脱液的pH值保持恒定。这一步骤确保了色谱柱上的可电离基团能够与带电的分析物分子相互作用。

　　2.上样——将溶解在初始缓冲液或与初始缓冲液pH值相同的缓冲液中的样品注入色谱柱。调节缓冲液的pH值和离子强度，使被分析物能与色谱柱结合，而杂质不能。

　　3.清洗  ——用初始缓冲液再次清洗色谱柱，以去除不带电荷的分子和带有与固定相相同电荷的分子。一旦杂质被洗掉，基线就会稳定下来。

　　4.洗脱——当洗脱缓冲液中的离子竞争并取代色谱柱表面带电位置上的分析物时，盐梯度用于洗脱结合的分析物。在低离子强度下，弱结合的分析物(表面电荷密度低的分子)开始从色谱柱中洗脱出来。随着盐浓度的增加，表面电荷密度越来越高的强结合分子依次从色谱柱上洗脱下来。或者，可以使用pH梯度洗脱结合的分析物，这些分析物以各自的pI值从柱中释放出来。为了洗脱阳离子，增加洗脱缓冲液的pH，同时通过降低洗脱缓冲液的pH从阴离子交换柱中洗脱阴离子。如果分子在其pI值沉淀，则不能使用pH梯度。

      5.色谱柱再生——最后，通过洗去结合在柱上的任何分子，柱的容量可以恢复用于下一次操作。因此，允许高离子强度缓冲液流经色谱柱，直到洗脱液的基线和pH值稳定。然后在下次运行前用初始缓冲液调整色谱柱。


　　虽然紫外线或荧光检测器在IEX最常用，但也使用其他检测器，如质谱仪、折光率(RI)或多角度光散射(MALS)检测器。